Kupas Tuntas Uji Antioksidan Dengan Metode DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Metode Antioksidan dengan DPPH
Metode yang familiar untuk mengetahui aktivitas antioksidan suatu senyawa adalah metode DPPH. Sebetulnya metode antioksidan ada 3 jenis yaitu: DPPH, FRAP dan CUPRAC, pada kesempatan ini saya akan lebih mengulas uji antioksidan dengan menggunakan metode DPPH.
DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang stabil, sehingga sering digunakan untuk menguji senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan dan vitamin yang bersifat antioksidatif. DPPH merupakan uji yang sederhana, mudah, peka, cepat dan membutuhkan sedikit sampel. Metode ini tidak memerlukan substrat karena radikal bebas sudah tersedia langsung untuk mengganti substrat.
Senyawa DPPH akan menghasilkan absorbansi yang kuat pada lamda max 517 nm jika diuji dengan metode spektrofotometri dan mempunyai warna ungu kuat. Senyawa DPPH akan berubah menjadi warna kuning jika bereaksi dengan senyawa antioksidan. Perubahan warna menunjukkan bahwa DPPH telah tereduksi oleh proses donasi hydrogen atau elektron dari senyawa antioksidan.
 |
| Certifikat of Analysis |
Bagi peneliti keaslian bahan merupakan faktor utama penunjang keberhasilan suatu penelitian. Jika sobat etiket farmasi membeli bahan baku, reagen maka pastikan kualitas dari bahan tersebut. Minta COA kepada pedagang dari bahan reagen tersebut. Didalam sertifikat of analisis sudah tercantum kapan reagen ini diproduksi dan waku ED, sehingga kita terhindar dari reagen yang ED. Grade reagen berbeda-beda apakah grade PA (pro analisa) grade teknis atau Grade for HPLC biasanya iasanya akan tertulis pada kemasan reagen.
Aktivitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan radikal DPPH melalui perhitungan presentasi inhibisi serapan DPPH dengan menggunakan rumus:
Apakah perlu pembanding Vit C dalam pengujian antioksidan? pada dasarnya Vit C merupakan senyawa yang mempunyai aktivitas yang sangat kuat IC 50 didapat 14 ppm dibanding Vitamin yang lain seperti Vitamin A dan E. Menurut beberapa penelitian aktivitas antioksidan Vit A sebesar 159 ppm dan Vit E sebesar 21 ppm
Dengan adanya pembanding Vit C kita bisa mengontrol apakah penelitian yang sudah kita lakukan berhasil apa tidak. Jika pada saat penelitian menggunkan Vit C hasilnya tidak memiliki aktivitas yang sangat kuat artinya ada kesalahan pada penelitian, mungkin bisa disebabkan rusaknya reagen DPPH, kesalahan prosedur atau alat spektrofotometer yang bermasalah.
Setelah mendapatkan data persen inhibisi maka selanjutnya adalah memasukkan ke dalam kolom excel untuk memunculkan persaman garis linier Y = a + bx. mencari hubungan antara konsentrasi X dan Y sebagai nilai persen inhibisi.
Sebelum sampai ketahap ini temen-temen harus paham dulu mengenai metode spektrofotrometri:
Secara kasar tanpa memasukkan nilai 50 ke persamaan kurva baku, kita sudah bisa memprediksi dari nilai % inhibisi. Menurut data hasil penelitian nilai 50% inhibisi diperoleh dengan konsentrasi sampel uji dengan kadar100 ppm dengan menghasilkan 52% inhibisi. Pertanyaan nya berapa nilai IC 50 yang tepat? Untuk mengetahui nilai yang tepat maka harus memasukkan nilai angka 50 ke persamaan regresi linier yang didapat dengan memasukkan nilai konsentrasi dan % inhibisi di microsoft excel.
Jika kita melihat hasil perendaman 52% di konsentrasi 100 ppm kita bisa menyimpulkan bahwa kemampuan sampel memiliki aktivitas anti oksidan yang kuat jika kita hubungkan pada tabel range tingkat kekuatan antioksidan.
Jika melihat range konsentrasi maka bisa disimpulkan semakin kecil nilai konsentrasi ppm sampel untuk menghasilkan nilai perendaman 50% maka senyawa tersebut memiliki potensi anti oksidan yang sangat kuat. Contoh Vit C setelah dilakukan pengujian aktivitas ontioksidan ternyata pada konsentrasi 30 ppm menghasilkan perendaman 50% artinya Vit C tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat.
Jika kita lihat tadi memakai metode kasar penentuan nilai IC50 melihat dari % inhibisi sekarang kita coba memasukkan rumus regresi linier yang didapat ketika kita memasukkan ke microsoft excel antara konsentrasi ppm dengan % inhibisi didapat Y = 0,2805x + 22,14
IC 50 memasukkan angka 50 ke 50 = 0,2805x + 22,14
x = 50 - 22,14 / 0,2805
x = 99,32 ppm hasil aktivitas anti oksidan secara perhitungan didapat 99,32 ppm artinya memiliki karakter aktivitas antioksidan yang kuat. Prediksi kasar dengan perhitungan setelah memasukkan ke persamaan regresi linier tidak jauh berbeda.
Pustaka:
Molyneux P. 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakari J. Sci. Technol. 26 (2) : 211-219
Lung JKS dan Destiani P. Uji aktivitas antioksidan vitamin A,C dan E dengan metode DPPH. Farmaka 15 (1): 53-62
Komentar
Posting Komentar